^شبكة الأبحاث _{الزراعية}

  المواد والطرق

النتائج

يمكن إستخدام ممرضات الحشرات الفطرية لمقاومة مجموعة من الحشرات المختلفة كطريقة من طرق المكافحة
البيولوجية للأفات . و من الممرضات الحشرية الفطرية المستخدمة في المكافحة البيولوجية للأفات فطر Beauveria bassiana (Bals.- Criv.) Vuill المسبب لمرض المسكاردين الأبيض لدودة الحرير.  و هو أيضا قادر على النمو داخل النبات endophytic دون أن يسبب مشاكل مرضية للنبات.  قد يوفر التكافل الداخلي endophytic من قبل ممرضات الحشرات الفطرية مصدراً للتفاعلات غير المباشرة بين الفطريات والحشرات ويرتبط بقدرة الفطر على السيطرة على الآفات الحشرية.  يعتبر حفار أوراق الطماطم (Tuta absoluta) (Meyrick) واحد من أكثر الآفات تدميراً في الطماطم (Solanum lycopersicum L.) ويصعب التحكم فيها بسبب سلوك الأنفاق التي تصنعها اليرقات ، ودورة الحياة القصيرة ، وقدرة التكاثر العالية.

تتمثل أهداف هذه الدراسة فيما يلي:

(1) استخدام ثلاثة أساليب مختلفة ، هي رش الأوراق و غمر البذور و غمس الجذور ، للتلقيح الفطري لـ B. bassiana في نباتات الطماطم ؛                                                                                                                                                                                 (2) تقييم تأثير B. bassiana على استهلاك أوراق الطماطم و نسبة موت T. absoluta بعد التلقيح.

تم تقييم نسبة الإحلال B. bassiana خلال فترات 7 و 14 و 28 يوما بعد التلقيح.  جميع تقنيات التلقيح المستخدمة سمحت باستعادة B. bassiana ، على الرغم من أن نتائجنا أظهرت اختلافات كبيرة بين التقنيات. كان رش الأوراق هي الطريقة الأكثر فاعلية ، حيث سجلت أعلى نسبة للإحلال بعد 7 أيام من التلقيح. 

قمنا أيضا بتقييم (1) التأثير على معدل موت T. absoluta عن طريق الاتصال المباشر مع غبيرات conidia الفطر B. bassiana ، و (2) التأثير على استهلاك أوراق الطماطم و نسبة الموت عن طريق الاتصال غير المباشر من خلال إبتلاع الأنسجة النباتية الملقحة بالفطر B. bassiana . أظهرت الاختبارات الحيوية لنسب الموت أن  فطر B. bassiana الممرض يصيب T. absoluta ، في كلتا الحالتين عن طريق الاتصال المباشر أو بشكل غير مباشر ، عن طريق إبتلاع أوراق الطماطم الملقحة بكونيديا  الفطر . أظهر الاتصال المباشر ارتفاع نسبة الموت و إنخفاض متوسط وقت البقاء حية (MST) أكثر من الاتصال غير المباشر. تم العثور على اختلافات كبيرة في نسبة موت T. absoluta بعد التعرض لفطر B. bassiana بين المعاملات و السيطرة (الكنترول). تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن التلقيح بالفطر الكامن بالنبات B. bassiana في محصول الطماطم يوفر الأساس لمزيد من البحث ، والذي يجب أن يركز على ضراوة الفطر B. bassiana ضد حفار أوراق الطماطم  T. absoluta.

المواد و الطرق

العزلات الفطرية

كانت السلالة الفطرية المستخدمة هي B. bassiana LPSC 1067 ، التي تم الحصول عليها من مجموعة " معهد سبيغازيني" ( جامعة لابلاتا الوطنية ) ، لابلاتا ، بوينس آيرس ، الأرجنتين. اعتمد اختيار هذه السلالة الفطرية على فعاليتها المختبرية ضد الحشرات الشائعة الأخرى في الأرجنتين (Pelizza et al. 2012a، b). تم التعرف على الأنواع باستخدام  الوراثة الجزيئية (رقم التسجيل في بنك الجينات KF500409) والبيانات المورفولوجية كما وصفها Russo et al. (2015).

تحضير معلق الجراثيم

تم الحصول على الغبيرات من المستعمرة النامية في بيئة أجار البطاطس بالدكستروز (PDA ، Britania S.A ، بوينس آيرس ، الأرجنتين) بعد التحضين لمدة 10 أيام عند 25 درجة مئوية في الظلام.  تم حصاد الغبيرات باستخدام كاشط الخلايا (Fisherbrand®) ووضعها في أنابيب اختبار تحتوي على 0.01٪ (حجم\حجم) توين 80 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) عديد  بوليسوربات (Merck®).  تم تثبيط المعلقات لمدة 2 دقيقة ، وتصفيتها من خلال أربع طبقات من الشاش المعقمة ، وتعديلها إلى 1 × 108 كونيدية ·\مل  (Gurulingappa et al. 2010) بعد عد الخلايا بإستخدام شريحة العد haemocytometer الألماني Neubauer .  تم تقييم قابلية الحياة و النمو للجراثيم قبل كل تجربة (Goettel and Inglis 1997).  تم تكرار اختبار الإنبات لكل معلق للحفاظ على ثبات تقييم القابليةعلى النمو . في جميع الحالات ، كان متوسط قابلية البقاء على قيد الحياة أكثر من 95 ٪.

نباتات الطماطم

تم الحصول على بذور الطماطم (Solanum lycopersicum صنف platense) من المزارع العضوية في محيط مدينة لابلاتا ، مقاطعة بوينس آيرس ، الأرجنتين (34 ° 57’17 ”S ، 57 ° 53’26” W).  لم تعامل البذور بأي معالجة كيميائية سابقة.  زرعت البذور في أوعية مملوءة بحوالي 86 جم من خليط التربة متساوٍى النسب من البيرلايت والفيرميكوليت والتربة (1: 1: 1) ، والتي تم تعقيمها في الأوتوكلاف لمدة ساعة واحدة على مدى ثلاثة أيام متتالية قبل الاستخدام. تم الاحتفاظ بالشتلات في الدفيئة عند درجة حرارة 24 درجة مئوية ، مع رطوبة نسبية 70٪ وتحت فترة ضوئية 12: 12 ساعة (ضوء : ظلام) 400 نانومول\ م2 · ث باستخدام مصباح من النوع الضوء البارد.

تم تعقيم بذور الطماطم عن طريق وضعها في الإيثانول بنسبة 70 ٪ لمدة 2 دقيقة ، ثم غسلها في الماء المقطر المعقم ، ثم الغمر في محلول 0.5 ٪ هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 1 دقيقة ، وشطفها مرة أخرى في الماء المقطر المعقم (Brownbridge et al. 2012).  وضعت البذور على ورق الترشيح المعقم حتى تجف لمدة 30 دقيقة ثم وزعت إلى جزئين . تم استخدام جزء واحد لتلقيح البذور واستخدمت المجموعة الأخرى لرش الأوراق وتغطيس الجذر بعد ظهور البادرات.

بالنسبة لتلقيح البذور ، تم غمر البذور (50 جم) في 10 مل من معلق الجراثيم (1 × 108 كونيدية \مل ) من فطر السكاردين B. bassiana لمدة 24 ساعة ، وفقًا لبراون بريدج وآخرون. (2012). بعد ذلك ، تم تجفيف البذور على مناديل ورق معقمة في خزانة التدفق الصفحي لمدة 30 دقيقة ، ثم تزرع في أوعية بعمق 4 سم ، ويتم الاحتفاظ بها في الدفيئة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية تحت فترة ضوئية 12: 12 ساعة (إضاءة: ظلام) . تم معاملة بذور السيطرة (الكنترول) 0.01 % من TWEEN® 80 خالي من الجراثيم (TWEEN® 80)

في حالة رش الأوراق وتغطيس الجذور ، زرعت البذور في أوعية مملوءة بما يقارب من 86 جم من خليط متساوي من البيرلايت والفيرميكوليت والتربة (1: 1: 1) ، والتي تم تعقيمه في الأوتوكلاف لمدة ساعة واحدة ثلاثة أيام متتالية قبل الاستخدام. بالنسبة لطريقة رش الأوراق ، تم رش أوراق نباتات الطماطم عندما وصل طول النبات 30 سم (7 أسابيع من العمر) بثلاثة مل من معلق الجراثيم (1 × 108 كوندريا \مل ) باستخدام بخاخ يد زجاجي (سعة 30 مل).  ولتفادي وصول المحلول للتربة ، تم تغطية الجزء العلوي من كل وعاء برقائق الألومنيوم (Posada et al. 2007).  تم رش نباتات السيطرة (الكنترول) 0.01 % من TWEEN® 80 خالي من الجراثيم  .

لتغطيس الجذور ، تم إستخدام الشتلات بعد ثلاثة أسابيع من الإنبات. تمت إزالة كل الشتلات من الوعاء وشطفها ثلاث مرات بالماء المقطر المعقم . تم تقليم أطراف الجذور من أجل امتصاص أفضل ووضعها بشكل فردي في أنابيب اختبار مع 2 مل من معلق الجراثيم (1 × 108 كونيدية\مل ) Akello et al. (2007). وتمت تغطية كل أنبوب بورق الألومنيوم. تم غمر جذور نباتات التحكم في الماء المقطر المعقم. تم تحضين نباتات التحكم عند 25 درجة مئوية ، مع رطوبة نسبية 80 ٪ وتحت فترة ضوئية 12: 12 ساعة (إضاءة : ظلام) لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم وضع كل من نباتات التحكم و المعاملات على ورق الترشيح المعقم حتى يتم تجفيفه بالكامل ثم إعادة زراعته في نفس الأواني.  تم ري الشتلات في جميع المعاملات حسب الحاجة وحفظها في دفيئة عند درجة حرارة 24 مئوية ، مع رطوبة نسبية 70٪ وتحت فترة ضوئية 12: 12 ساعة (إضاءة : ظلام) . لكل من طرق التلقيح الثلاثة ، تم إجراء 30 مكررة متماثلة لكل شتلة في المعاملات و  10 مكررات للسيطرة. 

تقييم وجود Beauveria bassiana باعتباره نابوت داخلي

تم تقييم مستعمرات B. bassiana في شتلات الطماطم في فترات 7 و 14 و 28 يوما بعد التلقيح. لتحديد الوجود المحتمل لهذه الفطريات في الأنسجة النباتية ، تم اختيار ورقة واحدة من كل نبات عشوائياً وتطهيرها بواسطة الغمس في 0.5٪ هيبوكلوريت الصوديوم لمدة دقيقتين ، ثم غمسها لمدة دقيقتين في 70٪ إيثانول وشطفها بماء مقطر معقم ( Arnold et al. 2001).  تم تجفيف الأوراق على مناشف ورقية معقمة في خزانة التدفق الصفحي وتم قطع حوافها لإزالة الأنسجة الميتة الناتجة عن عملية التطهير . تم فحص التطهير الكامل  للأوراق عن طريق إضافة 100 مل من ماء الشطف السابق من كل عينة على PDA. بالإضافة إلى ذلك ، تم الضغط على عينات فرعية من الأوراق المطهرة السطحية ضد PDA لتحديد ما إذا كانت الكويندات المتبقية تحتفظ بالإمكانات الجرثومية (Gurulingappa et al. 2010). تم قطع الأوراق إلى ستة أقسام 1 سم 2 تقريباً لكل قطعة باستخدام مشرط معقم. بالنسبة لكل من تقنيات التلقيح التي تم إختبارها ، تم استخدام ستة أقسام من كل من النباتات الـ 30 المعالجة وستة أقسام من نباتات السيطرة . 

مخزون 0.1 ٪ من 0.02 جرام من كل مضاد حيوي (تتراسيكلين ، ستريبتوميسين ، وبنسلين) يذاب في 10 مل ماء مقطر معقم ، يليه الترشيح معقم من خلال مرشح 0.2 ميكرون (معقم تصفية المحاقن ، E-Chrom Tech ، تايوان) تم إعداده ، ثم تمت إضافة 1 مل من هذا المخزون لكل لتر من البيئة (Vega et al. 2008).  تم وضع أقسام ورقة على أطباق تحتوي على PDA مع المضادات الحيوية. لكل تقنية التلقيح ، قمنا بعمل 30 مكررة لكل شتلة معالجة و 30 مكررة لنباتات السيطرة . تم فحص ما مجموعه 120 نبات و 720 ورقة. تم تسجيل وجود أو عدم وجود الفطر  B. bassiana على مقاطع الأوراق بعد 10 أيام عند 25 درجة مئوية. تم التعبير عن المعطيات على أنها تواتر الاستعمار (عدد أقسام الأوراق المستعمرة \ العدد الإجمالي لأقسام الأوراق) × 100 (Petrini and Fisher 1986).

تربية الحشرات

 تم جلب مستعمرة Tuta absoluta في عام 2011 من المواد النباتية الموبوءة باليرقات التي تم جمعها من المحاصيل دون أي تاريخ سابق للمعاملة بالمبيدات الحشرية ، في الحقول المحيطة بمدينة La Plata ، الأرجنتين (35 ° 01’24.97’’س ، 58 ° 03’34.69’’W) .  تم الاحتفاظ بالمواد النباتية تحت الحجر الصحي للتخلص من وجود الأمراض والطفيليات المحتملة ومن ثم دمجها في المستعمرة. بشكل دوري ، كانت المستعمرة مليئة بالمخزونات البرية التي تم جمعها من نفس المنطقة الجغرافية ، للحفاظ على تباينها الجيني.  كانت اليرقات تغذي شتلات الطماطم الخالية من المبيدات الحشرية (S. lycopersicum cv. platense) بينما تم تغذية البالغين بنسبة 15٪ من محلول مياه العسل. وجرى الحفاظ على مستعمرة الحشرات وجميع الإختبارات البيولوجية في المختبر تحت ظروف محكومة: 25 ± 2 °C و رطوبة نسبية ، 70 ± 5٪  و الفترة الضوئية 14: 10 ساعة (إضاءة : ظلام) . 

النتائج

قمنا بتقييم تواتر الاستعمار لفطر  B. bassiana  المستنبت من نباتات الطماطم  وفقا لتقنية التلقيح (رش الأوراق ، غمس الجذر ، غمر البذور) ، بعد التلقيح (7 ، 15 ، 28 يومًا) والتفاعل بين هذين المتغيرين.  أظهرت النتائج وجود فروق معنوية بين تقنيات التلقيح (F = 13.9 ؛ df = 2 ؛ p <0.001).  أسفر الرش عن أعلى تواتر (10٪) ، 27 نباتًا ملقحا ، تبعه غمس الجذور (5.56٪) و غمر البذور ، والذي أظهر انخفاضًا ملحوظًا في القيم (0.93 ٪) ، 16 و 2 النباتات الملقحة على التوالي.  وجدت فروق ذات دلالة إحصائية في إستعمار B. bassiana بين أوقات ما بعد التلقيح (F = 36.06 ؛ DF = 2 ؛ P <0.001) .  تم الحصول على أعلى نسبة من الاستعمار بعد 7 أيام من التلقيح (13.89 ٪) وأدنى نسبة بعد 28 يوما (0.56 ٪).  كما أظهر التفاعل بين تقنيات التلقيح وأوقات ما بعد التلقيح اختلافات معنوية (F = 17.97 ؛ df = 4 ؛ p <0.001).  سجلت أعلى القيم بعد 7 أيام من التلقيح باستخدام كل من رش الأوراق (متوسط القيم: 29.44٪) وغمس الجذور (متوسط القيم: 12.22٪).  كانت القيم المتبقية المسجلة للتفاعل بين هذه المتغيرات أقل بكثير (الشكل 1).  وبالمثل ، لوحظ أن التنفيذ التحولي ، الذي قدرته النسبة المئوية من الإستشفاء بعد التلقيح للفطر  B. bassiana ، إنخفض مع مرور الوقت.  لم يكن Beauveria bassiana معزول من نباتات السيطرة أو وجد في الأوراق المعقمة سطحيا (Gurunligappa et al. 2010). في جميع الحالات ، كان متوسط قابلية البقاء على قيد الحياة أكثر من 95 ٪.